Genetic Alterations in Pheochromocytoma and Paraganglioma

Pheochromocytomas and paragangliomas are neuroendocrine tumors that arise from neural crest-derived cells of the adrenal medulla and the extra-adrenal paraganglia. They cause hypertension due to an abnormally high production of catecholamines (mainly adrenaline and noradrenaline), with symptoms including recurrent episodes of headache, palpitations and sweating, and an increased risk of cardiovascular disease. Malignancy in the form of distant metastases occurs in 10-15% of the patients. The malignant cases are difficult to predict and cure, and have a poor prognosis. About a third of pheochromocytomas and paragangliomas are caused by hereditary mutations in a growing list of known susceptibility genes. However, the cause of the remaining, sporadic, tumors is still largely unknown. The aim of this thesis project has been to further characterize the genetic background of pheochromocytomas and paragangliomas, with a focus on the sporadic tumors. First, we investigated the role of the genes known from the familial tumors in the sporadic form of the disease. By studying mutations, copy number variations, DNA methylation and gene expression, we found that many of the known susceptibility genes harbor somatic alterations in sporadic pheochromocytomas. Particularly, we found that the NF1 gene, which plays an important role in suppressing cell growth and proliferation by regulating the RASMAPK pathway, was inactivated by mutations in more than 20% of the cases. The mutations occurred together with deletions of the normal allele and were associated with a reduced NF1 gene expression and a specific hormone profile. We also detected activating mutations in the gene EPAS1, which encodes HIF-2α, in a subset of sporadic cases. Microarray analysis of gene expression showed that several genes involved in angiogenesis and cell metabolism were upregulated in EPAS1-mutated tumors, which is in agreement with the role of HIF-2α in the cellular response to hypoxia. In order to comprehensively investigate all the known susceptibility genes in a larger patient cohort, we designed a targeted next-generation sequencing approach and could conclude that it was fast and cost-efficient for genetic testing of pheochromocytomas and paragangliomas. The results showed that about 40% of the sporadic cases had mutations in the tested genes. The majority of the mutations were somatic, but some apparently sporadic cases in fact carried germline mutations. Such knowledge of the genetic background can be of importance to facilitate early detection and correct treatment of pheochromocytomas, paragangliomas and potential co-occurring cancers, and also to identify relatives that might be at risk. By sequencing all the coding regions of the genome, the exome, we then identified recurrent activating mutations in a novel gene, in which mutations have previously only been reported in subgroups of brain tumors. The identified mutations are proposed to cause constitutive activation of the encoded receptor tyrosine kinase, resulting in the activation of downstream kinase signaling pathways that promote cell growth and proliferation. In summary, the studies increase our biological understanding of pheochromocytoma and paraganglioma, and possibly also co-occurring cancers in which the same genes and pathways are involved. Together with the findings of other scientific studies, our results may contribute to the development of future treatment options. POPULÄRVETENSKAPLIG SAMMANFATTNING Feokromocytom och paragangliom är tumörer i binjuren respektive paraganglierna som ofta producerar stora mängder av stressrelaterade hormoner, t.ex. adrenalin. De orsakar därför högt blodtryck, med relaterade symtom som hjärtklappning, svettningar, huvudvärk samt en ökad risk för potentiellt dödlig hjärtoch kärlsjukdom. Många av tumörerna är godartade i meningen att de inte ger upphov till spridd cancer, men drygt en tiondel av fallen är elakartade och har en dålig prognos, med ca 50l% femårsöverlevnad. Idag finns det inga säkra sätt att förutsäga om en tumör är elakartad och inte heller någon effektiv behandling för tumörer som spridit sig. Det saknas även kunskaper om de biologiska mekanismer som styr tumörernas uppkomst. Omkring en tredjedel av tumörerna är kopplade till ärftliga tumörsyndrom som orsakas av medfödda mutationer i specifika kända gener. De resterande fallen utgörs av sporadiska tumörer, och vad som orsakar dessa vet man mycket lite om. Syftet med detta avhandlingsprojekt har varit att kartlägga den genetiska bakgrunden till feokromocytom och paragangliom, med fokus på sporadiska tumörer. Projektet började med att vi undersökte de gener som är kända från ärftliga feokromocytom och paragangliom i den sporadiska formen av sjukdomen. Resultaten visade att flera av dessa gener också är förändrade i de sporadiska tumörerna. Förändringarna var förvärvade, d.v.s. de förekom i tumörernas DNA men inte i patienternas normala DNA. Vårt viktigaste fynd var att genen NF1, som tidigare inte misstänkts i de sporadiska tumörerna, var muterad i mer än 20l% av fallen. Genen har en viktig reglerande roll när det gäller att hindra celler från att dela sig, men denna funktion förstörs då genen muteras. Vi hittade även genetiska förändringar i en annan gen, som har en viktig roll i cellernas svar på syrebrist. Det visade sig att tumörer med dessa mutationer molekylärbiologiskt tillhör en annan grupp än de med NF1-mutationer, vilket kanske kan komma att ha betydelse för behandlingen av patienterna. I nästa steg satte vi upp en ny typ av DNA-sekvenseringsteknik för att undersöka ett stort antal tumörer. Vi fann att cirka hälften av tumörerna har mutationer i någon av de kända generna, samt att den nya tekniken kan vara lovande för snabb och kostnadseffektiv klinisk genetisk testning. Några av fallen som verkar vara sporadiska visade sig i själva verket ha ärftliga mutationer. Att hitta sådana fall kan vara av stor vikt, dels för att kunna ge rätt behandling och upptäcka tumörer tidigt, och dels för att kunna identifiera släktingar som riskerar att drabbas. I den sista delen av projektet var målet att söka efter nya gener som är inblandade i de tumörer som man hittills inte vet någonting om. Vi använde en ny teknik för att undersöka de kodande delarna av alla mänskliga gener och hittade då förändringar i en för sjukdomen helt ny gen, i vilken mutationer tidigare bara setts i ett fåtal hjärntumörer. Tillsammans har resultaten från dessa studier gett oss en ökad förståelse för hur feokromocytom och paragangliom uppstår, och förhoppningsvis kan detta bidra till utvecklingen av framtida behandlingsmetoder.